结直肠癌KRAS基因突变检测方法的应用和评价

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作者：叶美华，何向蕾（浙江省人民医院病理科），来茂德（通信作者，浙江大学医学部病理学与病理生理学系）

来源：中华病理学杂志转载自病理之家微信号

西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药作为结直肠癌有效治疗药物已广泛应用于临床。临床资料表明，KRAS基因突变患者对这种单抗药物并无明显效果，只有野生型患者才能从中获益。因此，临床上将KRAS基因突变状态作为一个重要的治疗标志物，它与结直肠癌的预后和治疗效果具有很强的相关性。2009年美国国立癌症综合网络（NCCN）结直肠癌临床实践指南规定，所有转移性结直肠癌患者必须检测KRAS基因突变状态，只有KRAS野生型才建议接受EGFR靶向治疗。同年，美国临床肿瘤学会（ASCO）也发布了同样的临床治疗建议，将其作为肿瘤靶向治疗的分子标志物，可见其重要指导意义。目前，KRAS基因检测在临床已普遍开展。我们主要就国内KRAS基因突变检测方法作一评价，供临床选择时参考。
一、结直肠癌中KRAS基因突变的阳性率

在结直肠癌中KRAS基因的突变率高达35%～45%，其高发的突变位点是第2号外显子上的第12、13号密码子，此外尚有第61、146号等较为罕见的突变位点。KRAS基因突变的检测方法有很多，包括直接测序法、高分辨率熔解曲线分析法（high resolution melting，HRM）、焦磷酸测序法、定量PCR法、突变扩增阻滞系统法（amplinc ationrefractorymutation system，ARMS）、限制性片段长度多态性聚合酶链反应法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、聚合酶链反应-单链构象多态性分析法（PCR-singlestrand confomation polymorphism，PCR-SSCP）、低变性温度下复合扩增聚合酶链反应法（co-amplification at lowerdenaturation temperatur PCR，COLD-PCR）以及高效液相色谱分析法等。我们对目前国内外KRAS突变的检出阳性率报道进行了总结（表1）。

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二、KRAS突变检测方法的评价

1、直接测序法：是检测KRAS基因突变最经典的方法，也是检测基因突变的金标准。基于双脱氧测序原理的直接测序法，能以碱基峰图的形式最直观的表现出基因序列的变化，检测类型较全面，也是应用最早的突变检测手段。尽管新一代测序平台层出不穷，国内外的学者依然以直接测序的检测结果作为标尺来衡量并判定新方法的可靠性。高静等对966例结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变的检测应用了直接测序法，这也是目前文献报道的国内样本量最大的KRAS基因突变分析。凌云等认为直接测序法是了解各基因突变状态最直接有效的检测方法，可明确突变类型，特别是对未知突变的检出具有优势。虽然该方法的敏感性相对较低，但可通过显微切割富集肿瘤细胞等方法得到很好改善。国内其他研究组的较大样本量的KRAS检测也应用了直接测序法。然而，敏感性较低是直接测序法的最大缺点。从国内报道的结果看，直接测序法突变检出率并不低。刘晓静等比较了直接测序法和肽核酸钳制PCR法（PNA-PCR），发现直接测序法检测到43例KRAS基因突变，PNA-PCR法除了检测出这些突变之外，还在直接测序法检测的野生型中发现10例突变，并提出建议用PCR法确定野生型患者、用直接测序法来确定突变型患者。邱田等通过荧光PCR-优化寡核苷酸探针法及直接测序法检测131例结直肠癌标本，检出KRAS基因突变阳性率分别为41.2%（54／131）和40.5%（53／131）。白冬雨等也探讨了不同方法的检测敏感性，200例结直肠癌患者中，RT-qPCR检测出突变63例，突变检出率31.5%；经直接测序法，测序成功的样品169例，检出突变50例，突变检出率29.6%。虽然直接测序法能够准确、客观、特异地检测出KRAS基因突变状态，但其对技术要求高、操作过程复杂、易造成交叉污染以及结果判读耗时费力等缺点也非常明显，并且各级医院中往往无测序设备，需将标本送往相应的公司进行检测，耗费时间长、成本较高，故有很大局限性。提取DNA时，必须严格控制标本，对HE切片刮取肿瘤细胞丰富的区域，尽量避开非肿瘤区、坏死区，使肿瘤成分所占比例较高，从而最大限度降低直接测序法检测基因突变出现假阴性的可能性。

2、焦磷酸测序法：从测序敏感性、检测成本和出报告的时间上看，焦磷酸测序法也是KRAS基因突变检测较为便捷的方法，该法的重复性较好，根据所得到的峰图，对于某个位点突变频率的定量研究和不同位点突变频率之间的比较都一目了然。近年来，Ogino等、Hutchins等运用焦磷酸测序技术，对大样本量结直肠癌患者进行的KRAS突变检测结果均提示，焦磷酸测序技术是筛选适用于靶向治疗患者的有力工具，在临床的肿瘤分子诊断中具有广阔的应用前景。国内也有学者应用焦磷酸测序技术在临床上对结直肠癌的KRAS突变进行检测，准确性及可靠性也都较好。该法具有较优的特异性和较高的敏感性。SundstrÖm等对在临床上应用的等位基因特异性PCR法及焦磷酸测序法作比较时发现，在314例结直肠癌患者的KRAS突变病例中，焦磷酸测序的特异性优于等位基因特异性PCR，且对低肿瘤细胞含量的组织具有较好的敏感性，将肿瘤细胞比例稀释至1.25%～2.5%，焦磷酸测序法依然可检测出突变信号。样本中突变等位基因最低含量需要达到20%才可被Sanger测序法检测出来时，达到10%即可被HRM法检测到，而对于焦磷酸测序只需达到5%就能成功检测出突变等位基因。我们应用焦磷酸测序法检测了717例结直肠癌患者的KRAS突变，发现KRAS基因突变频率为40.9%。其中第12号密码子突变率为30.1%，第13号密码子突变率9.8%，第61号密码子突变率1.0%。我们在检测前通过手工微切割方法富集了肿瘤含量较高的组织，使得结果更可靠。该方法敏感性、特异性均较好，在临床中也较容易开展。焦磷酸测序的缺陷是检测成本高，测序样本制备单链DNA的过程较为繁琐，未来的焦磷酸测序可致力于开发直接用双链PCR产物检测的技术，这样会在很大程度上简化操作，并有效的降低测序成本，以实现临床检测上的全面推广。

3、ARMS法：该技术使用引物对野生型、突变型基因进行区分，早在20世纪80年代就被报道过。该方法最大的优点是敏感性高达1.0%，可检测出样品中含量低至1.0%的突变基因。在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，解决因石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难题。该技术结合即时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。目前国际上较常用的是将蝎形探针（scorpion）及扩增阻滞突变系统结合起来的scorpion-ARMS法。2种技术的结合能使双方的敏感性和特异性最大化。高洁等用该方法检测了167例结直肠癌患者的KRAS基因突变状态，提示该法可靠且准确。王慧等也用ARMS法检测了151例甲醛固定、石蜡包埋组织的KRAS突变。在美国，被FDA批准用于KRAS临床检测的COBAS试剂盒（Roche公司）以及通过欧盟体外诊断（CE-IVD）认证的Therascreen RGQ试剂盒（Qiagen公司），都采用了ARMS原理。在常见方法中，ARMS法的敏感性最高，成本也较为合理，因此国内外很大一部分KRAS基因的临床检测均采用ARMS法，但由于该法基于PCR技术，其不足之处是仅能检测出已知位点的突变。

4、即时荧光定量PCR法：是一种以PCR为基础，通过Ct值来判定突变与否的检测方法，它具有特异性强、敏感性高、定量准确、操作简便、全封闭反应等优点。诸多实验组对结直肠癌的KRAS突变检测都采用此方法。与直接测序法相比，定量PCR在敏感性上占有较大优势，对2种方法做比较的学者大多认为定量PCR更灵敏。刘伟等用2种方法对280例结直肠癌KRAS基因突变的检测结果做了详细的分析，KRAS基因测序突变病例94例，阳性率33.57%（94／280），其中，即时荧光定量PCR阳性91例，敏感性96.8%（91／94）。186例基因测序野生型病例中，即时荧光定量PCR阴性184例，特异性98.9%（184／186）。即时荧光定量PCR法与直接基因测序法符合率为98.2%。在2种检测方法中，各突变位点的阳性一致率和阴性一致率均在90%以上，其中4个位点的符合率达到100%，2种方法的检测结果高度一致，表明荧光定量PCR是突变检测的一个较可靠的方法。但基于PCR的方法均需要根据已知的突变类型设计引物、探针，因此无法检出所有可能的突变，只能检测特定的位点。若某一位点不包含在试剂盒检测范围内中，即使实际存在突变，试剂盒结果依然为阴性。另外，定量PCR的敏感性虽高，但是否存在假阳性，仍需要通过DNA测序技术进行验证，或通过大样本量的回顾性、前瞻性临床实验确认KRAS突变状态与靶向药物疗效的相关性。因此，不可一味追求突变检测的高敏感性，而忽视对检测特异性和准确性的考量。不同实验室条件下，标本中突变检测的最适方法也可能不同，对突变比例较高的标本，Sanger测序法检测基因突变的准确性较高，而对突变比例较低的标本，Sanger测序法可能出现假阴性，以荧光PCR为技术平台的检测方法敏感性较高的特点才能得以体现。

5、HRM法：是近年来较常用的基因检测方法之一，具有操作简便、快速、灵敏、单管避免污染等优点。为探讨其用于临床检测的可行性，刘丽琴等用HRM法检测64例结直肠癌患者KRAS基因突变情况，再用直接测序法对结果进行验证。发现HRM法与直接测序法的结果一致，与直接测序法相比，HRM法检测KRAS基因突变具有简便准确的特点，提示其是适合应用于临床检测的一个可靠方法。陈志红等采用HRM法对含不同比例KRAS突变型质粒的系列混合样本进行检测，以评价其敏感性，发现可检出混合样本中质粒突变比例为10%，其敏感性达10%。其后用该法对60例结直肠癌患者组织标本检测KRAS基因突变，与直接测序法相比HRM法检测的敏感性为100%，特异性为96%（43／45）。HRM法的缺点是无法准确提供具体的突变类型以及到底是哪个密码子发生了突变。若在熔解曲线上发现有异常还需要用测序方法确定突变种类。Harlé研究组用156例结直肠癌组织对荧光PCR、ARMS及HRM法做了检测比较，结果提示尽管3种方法都适用于临床检测，但HRM可靠性不及另外2种方法。

6、其他方法：除以上提到的几种方法之外，其他检测方法在应用中也是各有优缺点，如PCR-SSCP、高效液相色谱法、荧光PCR-优化寡核苷酸探针法、套式PCR与ARMS结合的方法、COLD-PCR法等。高效液相色谱法特异性强，但是对样本的需求量大；PCR-SSCP成本低，经济实惠，但操作繁杂；以荧光PCR为平台的突变检测技术具有特异性强、敏感性高、定量准确、操作简便、全封闭反应等优点，但均需要根据已知的突变类型设计引物、探针，因此只能检测特定的位点，无法检出所有可能的突变。

三、小结

综上所述，由于不同实验室检测的突变位点及检测方法并不统一，所分析的肿瘤标本大小和DNA提取质量也是参差不齐，导致各实验室间的实验结果存在或大或小的差异，KRAS基因突变检测标准化成为各国关注的临床检测问题。目前，有很多方法可检测KRAS基因的突变，敏感性从高到低依次为ARMS法、焦磷酸测序法、HRM法、即时定量PCR法、直接测序法。从临床实际出发，敏感性低不利于临床治疗，但过于敏感的方法会造成检测特异性下降，可能会出现不必要的假阳性结果而影响患者后续的用药方案。综合以上几个方面考虑，结合FDA批准的方法，推荐用ARMS法。当然从市场角度讲，分子诊断不应该强调方法，而是关注最终的正确结果。不同实验室可以根据实际情况采用适合的检测方法，但前提是具有良好的操作人员资质和内部质量控制体系。在国内目前的实验室环境条件下，需要在标准化PCR实验室内进行检测，参加国内、国际室间质控活动保证实验室检验质量可靠。标准化管理是保证结果恒定的必要条件。我国在KRAS基因的临床检测方面亟待统一标准并实现规范化，根据不同需求生成一个标准化、规范化的检测程序，并可将该程序推广到BRAF、PIK23450_3CA、EGFR等基因的检测当中，促进临床分子病理检测的发展。